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蛋白质鉴定

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蛋白质鉴定

  ● 分子量检测

  ● 氨基酸序列分析(PMF)

  ● 未知蛋白鉴定

  ● 糖基化修饰肽段鉴定

  ● 翻译后修饰鉴定

★ 蛋白质质谱鉴定技术原理和方法

MALDI-TOF

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱技术(Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight, MALDI-TOF)的基本原理是将分析物分散在基质分子中并形成晶体,当用激光照射晶体时,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质和分析物共结晶升华进入气相。MALDI所产生的质谱图多为单电荷离子。MALDI产生的离子常用飞行时间(TOF)检测器来检测,理论上讲,只要飞行管的长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的,因此MALDI-TOF质谱很适合对蛋白质、多肽等生物大分子的研究。

 

 

★ 技术特点

  ● MALDI-TOF 鉴定方便、快速,可以同时做上百个斑点

  ● 主要用于纯蛋白或简单样本的鉴定,如SDS-PAGE斑点、2-DE斑点

  ● 成本较低

★ 样品要求

  ● 蛋白质溶液:纯度> 90%;蛋白质总量> 5 ug,浓度> 0.1 ug/ul

  ● 双向凝胶电泳点:考染、银染点清晰可见

  ● SDS-PAGE胶条:单一蛋白质,考染、银染条带清晰可见

★ 质谱技术的应用

1. 蛋白质纯度分析以及分子量测定

MALDI-TOF是一种软电离技术,可用于检测目标蛋白或多肽是否存在,有无二聚体存在,以及进行纯度情况的大体评估。MALDI-TOF鉴定分子量范围也非常广,能够鉴定700-1000000Da的蛋白分子量,准确度高达0.1%~0.01%,远远高于目前常规应用的SDS电泳与高效凝胶色谱技术。

2. 蛋白指纹谱鉴定(PMF)

肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)是蛋白质被识别特异酶切位点的蛋白酶水解后得到的肽片段的质量图谱。由于每种蛋白的氨基酸序列(一级结构)都不同,当蛋白被水解后,产生的肽片段序列也各不相同,因此其肽质量指纹图也具有特征性。将肽谱图与数据库中蛋白质理论肽谱图对比,从而鉴定蛋白质。因此,分子质量的精确度是PMF的关键指标所在,但蛋白质的翻译后修饰可能使PMF的质量数与理论值不符,从而对蛋白鉴定的准确度有一定影响。

3. MS/MS串联质谱法测序

串联质谱法(MS/MS),是目前常用的质谱鉴定方式。MS/MS先通过一级质谱测定肽段质量,再选取丰度高的肽段进行二级质谱分析,在二级质谱中肽段相互碰撞导致氨基酸键断裂,产生肽段碎片离子经由检测器分析,从而得到筛选肽段的氨基酸序列信息。MS/MS利用丰富肽段碎片的精确质量信息,更具有特异性、可信度,极大地增加了数据库检索的可靠性。

 

 

 

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